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    植物蛋白質(zhì)提取方法總匯

    發(fā)布時(shí)間: 2010-03-25  點(diǎn)擊次數(shù): 3144次

    一、植物組織蛋白質(zhì)提取方法
      1、根據(jù)樣品重量(1g樣品加入3.5ml提取液,可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入),準(zhǔn)備提取液放在冰上。
      2、把樣品放在研缽中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上靜置(3-4小時(shí))。
      3、用離心機(jī)離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
      4、提取上清液,樣品制備完成。
      蛋白質(zhì)提取液:300ml
      1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml
      2、甘油(Glycerol)75ml
      3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g
      這種方法針對(duì)SDS-PAGE,垂直板電泳!
      
      二、植物組織蛋白質(zhì)提取方法
      氯醋酸—丙酮沉淀法
      1、在液氮中研磨葉片
      2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜,然后離心(4℃8000rpm以上1小時(shí))棄上清。
      3、加入等體積的冰浴丙酮(含0.07%的β-巰基乙醇),搖勻后離心(4℃8000rpm以上1小時(shí)),然后真空干燥沉淀,備用。
      4、上樣前加入裂解液,室溫放置30分鐘,使蛋白充分溶于裂解液中,然后離心(15℃8000rpm以上1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)),可臨時(shí)保存在4℃待用。
      5、用Brandford法定量蛋白,然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆谩?br />  藥品:提取液:含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮。裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中(終體積為5ml),使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
      這種方法針對(duì)雙向電泳,雜質(zhì)少,離子濃度小的特點(diǎn)!當(dāng)然單向電泳也同樣適用,只是電泳的條帶會(huì)減少!
      
      三、組織:腸黏膜
      目的:WESTERN BLOT檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
      應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟:
      含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇:(1.5ml每1mlTRIPURE用量)
      倒轉(zhuǎn)混勻,置室溫10min
      離心:12000 g,10min,4度,棄上清
      加入0.3M鹽酸胍/95%乙醇:(2ml每1mlTRIPURE用量)
      振蕩,置室溫20min
      離心: 7500g,5 min,4度,棄上清
      重復(fù)0.3M鹽酸胍/95%乙醇步2次
      沉淀中加入100%乙醇 2ml
      充分振蕩混勻,置室溫20 min
      離心: 7500g,5min,4度,棄上清吹干沉淀
      1%SDS溶解沉淀
      離心:10000g,10min,4度
      取上清-20度保存(或可直接用于WESTERN BLOT)
      存在的問題:加入1%SDS后沉淀不溶解,還是很大的一塊,4度離心后又多了白色沉定,SDS結(jié)晶?測(cè)濃度,含量才1mg/ml左右。
      解決:提蛋白試劑盒,另外組織大小適中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮5-10分鐘,效果很好的。
      
      四、植物材料:水稻苗,葉鞘,根
      1、200毫克樣品置于冰上磨碎
      2、加lysis buffer,離心,10000rpm,4度,5min取上清
      3、重復(fù)離心5min
      lysis buffer:urea np-40 ampholine 2-me pvp-40
      
      五、蛋白質(zhì)樣品制備
      秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal等(1986)的方法進(jìn)行。
      100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% 三氯乙酸(丙酮配制,含10mM即0.07%β-巰基乙醇),混勻,-20℃沉淀1小時(shí),4℃,15000 r/min離心15 min,棄上清,沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇),再于-20℃沉淀1小時(shí),同上離心棄上清,(有必要再用80%丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。
      按每mg干粉加入20μl(可調(diào)) UKS液[9.5 M尿素,5mM碳酸鉀,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫蘇糖醇),2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100],37℃溫育30min,期間攪動(dòng)幾次,28度 (溫度低,高濃度的尿素會(huì)讓溶液結(jié)冰)16000 r/min離心15 min,離心力越大時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)越好!上清即可上樣電泳?;蛘?70度保存
      
      六、植物根中蛋白質(zhì)的抽取
     ?。?) sample, 液氮研磨
     ?。?) 裝1.5 ml centrifuge 用tube
     ?。?) 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul
     ?。?) 12000 rpm, 4度, 10-15minite
      (5) 取上層液,蛋白質(zhì)就在里面 
     

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