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    我公司分享:樣本制備方法之蛋白提取的總原則及注意事項

    發(fā)布時間: 2016-08-12  點擊次數(shù): 1257次

    樣本制備是實驗的*步,也是決定實驗成敗的關(guān)鍵步驟,獲得的蛋白質(zhì)樣品必須均質(zhì)、可溶,并解離成單個多肽亞基,且盡量減少相互間的聚集,使其zui終僅依賴本身的分子量大小進行分離。常見的樣本來源有重組蛋白、細(xì)胞和組織等。今天我司小編與您一起分享關(guān)于蛋白提取的總原則以及注意事項:
    蛋白提取的總原則和注意事項:
    1. 盡可能提取*或降低樣本復(fù)雜度,只集中提取目的蛋白;
    2. 保持蛋白處于溶解狀態(tài)(通過裂解液的pH鹽濃度,表面活性劑,還原劑等的選擇);
    3. 提取過程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等(低溫操作,加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑);
    4:盡量除去核酸、多糖、脂類等干擾分子(通過加入核酸酶或采取不同提取策略);
    5:樣品分裝,長期于-80℃保存,避免反復(fù)凍融。

    細(xì)胞裂解:
    1. 培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗2次,裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑;
    2. 吸盡PBS,加入預(yù)冷的裂解液(1ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask);
    3. 用細(xì)胞刮子刮取貼壁細(xì)胞,將細(xì)胞及裂解液溫和地轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的微量離心管中;
    4. 4℃搖動30mins;
    5. 4℃,12000rpm離心20mins;
    6. 輕輕吸取上清,轉(zhuǎn)移至新預(yù)冷的微量離心管中置于冰上,即為蛋白樣本,棄沉淀。

    組織裂解:
    1. 用滅菌的預(yù)冷的工具分離目的組織,盡量置于冰上以防蛋白酶水解;
    2. 將組織放在圓底微量離心管或EP管中,加入液氮凍結(jié)組織于冰上勻質(zhì)研磨,長期可保存于-80℃;
    3. 每5mg加入約300ul預(yù)冷的裂解液,冰浴勻漿后置于4℃搖動2小時,裂解液體積與組織樣本量有適當(dāng)比例(zui終的蛋白濃度至少達0.1mg/ml,理想的蛋白濃度應(yīng)為1-5mg/ml);
    4. 4℃,12000rpm離心20mins,輕輕吸取上清,轉(zhuǎn)移至新預(yù)冷的微量離心管中置于冰上,即為蛋白樣本,棄沉淀。
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